科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答：

⑴步骤①和②中常用的工具酶是 。

⑵经过①和②步骤后，有些质粒上的 基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒。

⑶步骤③是 的过程。为了促进该过程，应该用 处理大肠杆菌。

⑷步骤⑤：用无菌牙签挑取C上的 菌落，分别接种到D和E两个培养基的相同位置上，再重复12次上述步骤，然后培养一段时间，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于（选填“D”或“E”） 上，请在图中相应的位置上圈出来。